Estandarización metodológica de la determinación inmunohistoquímica de la subunidad-1 del receptor N-metil-D- aspartato (NMDR-1) en las neuronas productoras de la hormona liberadora de las hormonas gonadotrofinas (GnRH) en el hipotálamo del ovejo

Abstract

Se estudió inmunohistoquimícamente la presencia de la subunidad-1 del receptor N-metil-D-aspartato (NmDAr-1) en neuronas productoras de la hormona liberadora de las hormonas gonadotroficas (gnrh) en muestras de hipotálamo fijadas en parafina, provenientes de cinco ovejos no castrados. Se evaluaron diferentes condiciones para las inmunoreacciones: sin y con recuperación antigénica (térmica y enzimática), diferentes diluciones de anticuerpos primarios (anti-NmDAr-1 y anti-gnrh), tiempos de incubación de anticuerpos y sistemas de amplificación y revelado. Se evaluó la recuperación térmica (recuperador Dako ph 6 y recuperador citrato ph 4) y la recuperación enzimática (incubación con tripsina). las diluciones de anticuerpos primarios fueron; 1/100 para anti-gnrh y 1/25 y 1/50 para anti-NmDAr-1, respectivamente. los resultados se analizaron según una escala de cruces que estimó cualitativamente la intensidad del inmunomarcaje de los tejidos. Se seleccionaron la recuperación antigénica térmica con citrato, dilución 1/25 del anticuerpo anti-NmDAr-1 y tiempo de incubación de 12 h, como condiciones óptimas para las inmunoreacciones con el anticuerpo anti-NmDAr-1. usando estas condiciones se detectó la presencia de la NmDAr-1 en membrana plasmática y citoplasma de las células reactivas de la región preóptica hipotalámica. para el anticuerpo anti-gnrh, hubo buen marcaje con dilución 1/100 del anticuerpo, sin recuperación antigénica e incubación durante 1 h y aplicación del sistema de revelado con peroxidasa. los resultados demuestran la posibilidad de usar muestras de tejido hipotalámico parafinado de ovinos para estudios inmunohistoquímicos del receptor NmDA.