Aislamiento y caracterización de la actividad trehalasa del Sitophilus oryzae (gorgojo de arroz)

Abstract

La trehalasa soluble de Sitophilus oryzae fue purificada parcialmente a partir de la fracción soluble obtenida del homogeneizado del insecto adulto. Inicialmente se realizó una precipitación salina con sulfato de amonio. Para esto, se ensayaron cinco concentraciones de sal. La concentración de 41% fue la utilizada en el proceso de purificación, debido a que a esta concentración hubo una mayor precipitación de las proteínas presentes en la fracción soluble (41%) y la mayor recuperación de actividad enzimática en el sobrenadante obtenido (84%). Este último fue cromatografiado en una columna hidrofóbica (Metil-HIC), encontrándose un pico de actividad enzimática con una recuperación de 48% y un enriquecimiento de la actividad específica de 3 veces, con respecto al paso anterior de purificación. Las fracciones con actividad eluidas de esta cromatografía fueron reunidas e inyectadas en una columna Bioselect-250, en la cual también se obtuvo un único pico de actividad enzimática con una recuperación de 89% y un enriquecimiento de 14 veces, con respecto al paso anterior. Al final del proceso de purificación se alcanzó un rendimiento de 36% y una actividad específica 6,73 U/mg de proteína. La masa molecular estimada por cromatografía de filtración en gel fue 123 kDa. El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la trehalasa soluble de S. oryzae, y esta presentó una cinética tipo Michaelis-Menten para una reacción con un único sustrato. El Km y la velocidad máxima determinada bajo esta condición fue 0,36 mM y 1,7x10-4 μmol de glucosa/minutos, respectivamente para una concentración de enzima de 2 U/mg en 100 μL de reacción.