“Uso de la espectroscopía de fluorescencia en la determinación de cambios conformacionales de la rodopsina bovina”

Abstract

La rodopsina es la proteína fotorreceptora de los bastoncillos de la retina. Esta, en presencia de luz, experimenta cambios conformacionales que se traducen en una serie de fotointermediarios, uno de los cuales es el responsable de transmitir la señal luminosa al resto de las proteínas de la cascada visual. De forma interesante, la fosforilación de la rodopsina fotoactivada constituye parte esencial en el mecanismo de inactivación o desensibilización de la rodopsina. El objetivo del presente trabajo es aplicar la espectroscopía de fluorescencia extrínseca para la detección de cambios conformacionales en la rodopsina. Para lograr tal cometido, se procedió en primera instancia, a aislar segmentos externos de los bastoncillos (SEB) a partir de retinas bovinas; los cuales contenían rodopsina con un alto grado de pureza de acuerdo al cociente de absorbancia A280nm/A500nm. La rodopsina bovina fue purificada mediante cromatografía de afinidad a través de Concanavalina A sefarosa, evidenciándose así que el detergente n-dodecil-β-D- maltósido solubilizaba a esta proteína de los SEB. Las cisteínas expuestas de la rodopsina fueron entonces marcadas con el fluoróforo monobromobimano (mBBr), bajo condiciones de oscuridad o luz, en presencia o ausencia de Mg+2-ATP y rodopsina quinasa. Las muestras resultantes del marcaje, fueron aisladas y analizadas fluorimetricamente. Se pudo evidenciar que el cambio de conformación que se produce en la rodopsina fotoactivada no ejerció ningún tipo de impedimento para que las cisteínas en la región citoplasmática quedasen disponibles para el marcaje con mBBr. Adicionalmente, se comprobó que los sitios de fosforilación de la rodopsina se encuentran próximos a las cisteínas modificadas con mBBr, puesto que la señal de la fluorescencia, se vio significativamente disminuida en las muestras que contenían rodopsina fosforilada.