Clonación y expresión de la proteína quimera Tv70CatL en un sistema bacteriano

Abstract

La tripanosomosis animal es una enfermedad parasitaria hemotrópica causada principalmente por Trypanosoma vivax, un hemoflagelado unicelular eucariota que afecta a bovinos, ovinos, caprinos y bufalinos; ocasionando pérdidas económicas importantes en la ganadería venezolana. Hasta la fecha, el serodiagnóstico está limitado debido a la ausencia de antígenos específicos para la identificación de T. vivax. Por otra parte, el uso de vacunas convencionales y de drogas tripanocidas no han proporcionado resultados efectivos ante la enfermedad. La clonación y expresión de proteínas quimeras constituyen la clave en el desarrollo de estrategias que puedan ser empleadas para el control y serodiagnóstico de la enfermedad. El principal objetivo de este estudio fue la clonación y expresión del gen quimera Tv70CatL en un sistema bacteriano. Este gen está formado por una región de 251 aminoácidos de la proteína de choque térmico de 70 Kda (Hsp70359-610) unida a la región catalítica de la cisteín proteasa, ambas de T. vivax. Se subclonó en el vector pET28a y se expresó en E. coli Bl21 (DE3) Rosetta transformado con el vector de expresión pET28a/Tv70CatL. Los clones fueron analizados por PCR de las colonias, obteniendo la amplificación de un producto de 1469 pb en 3/7 de las colonias y fueron comprobadas por digestión con enzimas de restricción. La expresión de la proteína Tv70CatL se obtuvo a 30˚C con IPTG 1mM y por inducción con lactosa a los 28 ˚C, confirmándose su presencia por western blot con el anticuerpo policlonal anti-Hsp70, el cual mostró una banda de 55 kDa. El análisis por zimografía no mostró actividad gelatinasa de la proteína bajo diferentes pH (3; 4,2; 7,2 y 9,6) a 37˚C en ausencia y presencia de los activadores L-Cys y CaCl2.