Identificación y clonación del gen que codifica la Proteína Paraflagelar 2 y una secuencia parcial de la Clatrina de Trypanosoma vivax

Abstract

La tripanosomosis bovina es una enfermedad fatal en bovinos, ovinos, caprinos y bufalinos, siendo Trypanosoma vivax su agente causal en Venezuela. Como todos los tripanosomatideos, presenta un flagelo situado en la parte anterior del parásito, que le otorga la movilidad. En el interior del flagelo, se encuentra el filamento paraflagelar (PFR). Entre las distintas proteínas que conforman el PFR se encuentran la proteína paraflagelar 2 (PFR2). La PFR2 es una proteína estructural que cumple un rol importante en la motilidad del parásito. T. vivax también presenta una invaginación profunda de la membrana plasmática en la base del flagelo, conocida como bolsillo flagelar. Esta estructura está asociada a los procesos endocíticos y de secreción de moléculas. Diversas proteínas están implicadas en estos procesos, entre ellas se encuentra la clatrina (CLH), una proteína estructural que recubre las vesículas en el proceso de transporte trans-membrana y está asociada en la incorporación de nutrientes al interior del parásito. El objetivo de este trabajo fue identificar y clonar el gen que codifica la PFR2 y la secuencia parcial de la CLH de un aislado venezolano (TvLIEM176) de T. vivax. Para ello, se realizaron estudios bioinformáticos que permitieron predecir la secuencia putativa de cada gen. De la secuencia obtenida se diseñaron cebadores para amplificar por PCR el gen que codifica la PFR2 (PFRFF/R) y la secuencia parcial de la CLH (CLHF/R), obteniéndose un único fragmento de 1800pb y de 535pb, respectivamente. El producto de PCR correspondiente al gen que codifica la PFR2 fue tratado con EcoRV, obteniéndose dos fragmentos, de 1152pb y de 648pb. El producto de PCR correspondiente a la secuencia parcial de la CLH se trató con la enzima KpnI, generando bandas de 432pb y de 103pb, ambas acordes con el tamaño esperado según el mapa de restricción obtenido por bioinformática. Se realizó la clonación de cada inserto en el vector p-GEMT easy. Las colonias fueron analizadas por PCR colony, tratadas con enzimas de restricción y secuenciadas automáticamente. La secuencia del clon se comparó con la secuencia putativa obtenida por bioinformática del gen que codifica la PFR2 y la secuencia parcial de la CLH, mostrando 95% y 99% de identidad respectivamente, siendo éstos los primeros reportes del gen que codifica la PFR2 y la secuencia parcial de la CLH de un aislado en Venezuela de T. vivax. Además, se presume que estas dos proteínas podrían servir como posible inmunógeno para el control de la tripanosomosis bovina en Venezuela.