Determinación de la factibilidad del sistema ARN antisentido como herramienta de análisis genético en Trypanosoma rangeli, acoplado al sistema de expresión condicional de genes ARNpT7/TetR.

Abstract

Los tripanosomátideos constituyen una familia de protozoos que incluye parásitos de importancia médica y veterinaria, entre los cuales se encuentran Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, y las diferentes especies de Leishmania causantes de diversos cuadros clínicos en humanos. Dentro de la familia del orden Kinetoplastida se encuentra Trypanosoma rangeli, parásito que infecta a humanos sin patologías asociadas a la infección en el hospedador vertebrado, el cual comparte con T. cruzi hospedadores vertebrados e invertebrados, reservorios y en consecuencia la distribución geográfica en el continente Americano. Ambos protozoarios han sido utilizados como modelos experimentales, para conocer y entender los distintos mecanismos que operan en los sistemas de interacción parásito-hospedador a nivel molecular. Para este abordaje molecular se han desarrollado herramientas genéticas, particularmente vectores de expresión específicos para tripanosomatídeos, permitiendo generar el fondo genético necesario para la producción condicional de ARN antisentido y ARN de interferencia (ARNi) in vivo. Basados en el conocimiento existente de los sistemas inducibles en Tripanosomatideos y la efectividad de la metodología del ARNi y ARN antisentido para la inactivación funcional de genes en T. brucei y Leishmania, en el Laboratorio de Genética Molecular nos hemos planteado determinar la factibilidad del sistema ARN antisentido en T. rangeli, acoplado a un sistema de expresión condicional de genes utilizando los vectores pLew13 y pTcIndex. La estrategia de trabajo planteo la construcción de líneas estables de T. rangeli mediante la inserción de pLew13 lineal en el genoma, mediada por recombinación homóloga de la región K tubulina presente en el vector. Contrario a lo esperado, el análisis del Southern blot determinó la ubicación episomal del vector pLew13 en los clones 1, 3 y 4, sin embargo el análisis por Western blot determinó la expresión estable del gen ARNpT7 en estas tres líneas. La evaluación preliminar de la organización de la tanda H-K tubulina en T. rangeli demostró la existencia de un polimorfismo en el sitio HindIII, presente en el gen de H tubulina de la cepa venezolana Triat-1, similar al reportado por Esquenazi y colaboradores (1989) en un aislado venezolano, y ausente en una cepa del amazonas, abriendo la posibilidad de utilizar este marcador para diferenciar los grupos poblacionales descritos en T. rangeli (Da Silva y col., 2007). La evaluación del sistema ARN antisentido planteo el clonamiento dirigido del gen de H tubulina de T. rangeli sentido y antisentido en el vector pTcIndex-RFP, utilizando los sitios XbaI y BamHI y partiendo del aislamiento del gen de los recombinantes pTrTriatalfatub 3 y pTrTriatalfatub 4. La verificación de los sitios XbaI y BamHI en pTcIndex-RFP demostró la presencia de sitios únicos de corte en posiciones espaciadas por 1600 pb, impidiendo su utilización para este clonamiento. En la actualidad planteamos el clonamiento dirigido del gen H tubulina en ambos sentidos en el vector pTcIndexI, utilizando los sitios _otI/BamHI. La transfección de pTcIndexHtub en líneas T. rangeli Triat-1[pLew13], permitirá evaluar la presencia del sistema ARN antisentido en T. rangeli, permitiendo así la utilización de esta herramienta en el análisis genético mediante Knock out funcionales.