ESTRATEGIAS PARA LA DETECCIÓN MOLECULAR TEMPRANA DE ALFAVIRUS POTENCIALMENTE EPIDÉMICOS

Resumen

El género Alfavirus incluye virus causantes de encefalitis: Encefalitis Equina del Este, EEE, Encefalititis Equina Venezolana, EEV ó de afectación articular: Chikungunya, Mayaro, Sindbis, todos potencialmente epidémicos. El objetivo del trabajo fue diseñar protocolos dePCR Multiplex para detección de alfavirus. Para ello, se alinearon 20 secuencias completas de cepas del complejo de EEV, incluyendo 17 epizoóticas aisladas en Venezuela (1969 a2001), Las cepas Trinidad Donkey y vacunal (TC-83), una Panameña de 1991 (enzoótica),usando SE-AL (v 2.0 para iOS). Se seleccionó una secuencia de 200 pb de la proteínaE2 conteniendo mutaciones no silentes, en las cepas epizoóticas y todas ausentes en las enzoóticas. Se diseñaron cebadores usando programas libres y evaluándolos con Mac Vector. PCR Multiplex: Las secuencias anteriores se alinearon con cepas de alfavirus aisladas en Venezuela (EEE, Mayaro, Chikungunya), seleccionándose una región cercana a la descrita previamente, así como el primer sentido usado por Seymour R (2015) para el diseño de cebadores anti-sentido usando SE-AL, a fin de amplificar los alfavirus mencionados por PCR Multiplex Los cebadores se evaluaron usando cepas del banco del Laboratorio Nacional de Galveston. Resultados y conclusiones. El uso de cebadores obtenidos para PCR multiplex funcionaron por separado y en combinaciones para la amplificación de alfavirus, potencialmente epidémicos.

Abstract

Alphavirus genera includes viruses causing encephalomyelitis (East equine encephalitis,EEE, Venezuelan equine encephalitis, VEE), or viruses causing articular pain (Chikungunya,Mayaro, Sindbis). All of them are epidemic threats. In order to design PCR multiplex protocolsfor alphavirus detection, we aligned 20 VEE complex complete sequences, including 17epizootic sequences isolated in Venezuela from 1969 to 2001, a Trinidad donkey strain,and an enzootic strain from Panama (1991) using SE-AL (iOS v. 2.0). We selected a 200bp E2 protein sequence from epizootic strains containing non silent mutations, all absentin enzootic strain. We designed primers using free programs for primers design and thenusing Mac Vector for primers evaluation. PCR multiplex: VEE sequences were aligned withother sequences belonging to alphaviruses isolated in Venezuela (VEEE, Mayaro, Chikv) and we selected a region and sense primer described by Seymour R (2015) for anti-senseprimer design using SE-AL. In order to amplify alphaviruses using multiplex PCR. Primerswere evaluated using strains from Galveston’s National Laboratory bio-bank. Results andConcluding Remarks: PCR multiplex primers worked separately and in some combinationsto amplifiy potentially epidemic alphaviruses.