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Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://hdl.handle.net/123456789/2296

Título : Purificación y caracterización de las isoenzimas de la pectina metilesterasa en frutos de níspero (Manilkara zapota var. Prolific)
Otros títulos : Purification and characterization of the isozymes of la pectna metilesterasa en fruits of loquat (Manilkara zapota var Prolific)
Autor : Bedoya, Angela
Palabras clave : Isoenzimas,
Maduración de frutos
Níspero
Pectina Metilesterasa (PME)
Sapodilla
Maturation of fruits
Pectin Methylesterase (PME)
Purification
Isoforms
Fecha de publicación : 8-Jan-2013
Citación : 2012;1387-0003
Resumen : El Níspero (Manilkara zapota) es un fruto muy apetecido por su aroma y agradable sabor. En Venezuela la producción del níspero está limitada a pequeños y medianos productores y la causa que más ha afectado el aumento de la producción y de la oferta en el mercado de este rubro es su acelerado proceso de maduración y el inadecuado manejo postcosecha. El proceso de ablandamiento o pérdida de firmeza durante la maduración de los frutos es consecuencia de los cambios bioquímicos producidos en la pared celular. Este estudio se realizó con la finalidad de purificar y caracterizar cinéticamente las isoenzimas de la PME en frutos de níspero (Manilkara zapota var. prolific). Se colectaron frutos de níspero en estado de madurez fisiológica y se almacenaron bajo congelamiento a -20ºC. Para la extracción de la enzima se tomaron 20 g de la pulpa del fruto, se le añadió nitrógeno líquido y se pulverizó en un mortero, luego se resuspendió en 20 mL de Tris-HCl (0,1M-pH 8) y se centrifugó a 10000 rpm x 30´. La medición de la actividad enzimática se realizó de acuerdo a la metodología de Hagerman y Austin (1986). El sobrenadante obtenido (20 mL) se filtró con lana de vidrio y fue almacenado a -20 ºC. A continuación se realizó la precipitación de la enzima con sulfato de amonio líquido. El pellet obtenido fue sometido a cromatografía de fraccionamiento con Sephadex G-50. Se determinó la glicosilación de la enzima mediante cromatografía de afinidad con la ConA-Sepharosa y con el Kit de glicosilación de Sigma. Se determinaron las constantes cinéticas de Km y Vmáx, la temperatura, el pH óptimo y la estabilidad al calor. Los resultados indican la existencia de dos isoenzimas de la PME, las cuales se denominaron PMEI y PMEII. La PMEI y la PMEII tienen igual Km, Vmáx y Peso Molecular pero difieren en su pH y temperatura óptima. La Km de la PMEI y la PMEII Km es de 1,15 μg/μL y la Vmáx es de 0,078 μmol, acido/min. La temperatura óptima de la PME I es de 50 ºC y de la PME II es de 25 ºC. El pH óptimo de la PME I es de 4 y de la PME II es 10. El Peso Molecular de la PME y de la PME está entre los 15 y 20 kDa. Ambas isoenzimas son termorresistentes, sin embargo la PME II es más estable que la PME I. Las isoenzimas de la PME en frutos de níspero son glicosiladas. Estos carbohidratos están compuestos por grupos manosídicos. Se recomiendan los siguientes aspectos para profundizar en el conocimiento sobre las PME: realizar la secuenciación de las isoenzimas, liofilizar las isoenzimas PME I y PME II de frutos de níspero, hacer pruebas a nivel agroindustrial para determinar la aplicabilidad de las isoenzimas de la PME de nísperos y realizar los análisis correspondientes para determinar el porcentaje y la composición de carbohidratos de las isoenzimas PME y PME II.
Descripción : The Sapodilla (Manilkara zapota) is a very desired fruit by its aroma and pleasant flavor. In Venezuela the production of the sapodilla is limited to small and medium producers and the cause that has affected more the increase of the production and the supply in the market of this fruit is the accelerated maturation process and the inadequate handling postharvest. The process of softening or loss of firmness during the maturation of the fruits is consequence of the biochemical changes produced in the cell wall. This study was realized in order to kinetically purify and to characterize isoforms of the PME in fruits of sapodilla (Manilkara zapota var. prolific). Fruits of sapodilla in state of physiological maturity were collected and they were stored under freezing -20ºC. For the extraction of the enzyme 20 g were taken from the pulp of the fruit, added liquid nitrogen and it pulverized in a mortar, soon (0,1M-pHs 8) were re-suspended in 20 ml of Tris-HCl and was centrifuged to 10000 rpm 30´.The measurement of the enzymatic activity was realized according to the methodology of Hagerman and Austin (1986). The obtained supernatant (20 mL) was filtered with glass wool and then stored to -20 ºC. Next the precipitation of the enzyme with liquid ammonium sulphate was realized. Pellet obtained was put under filtered chromatography with Sephadex G-50. The glycosylation of the enzyme by means of chromatography of affinity with the ConA-Sepharosa and the Kit of glicosylation of Sigma was determined. The kinetic constants of Km and Vmáx, the temperature, the optimal pH and the stability to the heat were determined. The results indicate the existence of two isoforms of the PME, which denominated PMEI and PMEII. The PMEI and the PMEII have equal km, Vmáx and molecular weight but defer in their pH and optimal temperature. Km of the PMEI and PMEII km μg/μL is of 1.15 μg/ μL and the 0.078 Vmáx is of μmol, acid/min. The optimal temperature of PME I is of 50 ºC and of PME II is of 25 ºC. The optimal pH of PME I is of 4 and of PME II he is 10. Molecular weight of the PME and the PME is between 15 and 20 kDa. Both isoforms are heat-resisting, nevertheless PME II is more stable than PME I. Isoforms of the PME in sapodilla fruits are glycosylated. This carbohydrate group is compound partly of manosydics groups. The following aspects are recommended to deepen in the knowledge on the PME: to realize the sequencing of isoenzimas, to lyophilize isoforms of PME I and PME II of sapodilla fruits, to test at agro-industrial level to determine the applicability of isoforms of the PME of sapodilla and to realize the corresponding analyses to determine the percentage and the composition of carbohydrates of isoforms PME and PME II.
URI : http://saber.ucv.ve/123456789/2296
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