SABER UCV >
2) Tesis >
Doctoral >

Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://hdl.handle.net/123456789/1985

Título : Aislamiento y purificación de proteasas y una fracción enriquecida en terpenos de látex de Calotropis procera y Pedilanthus tithymaloides y evaluación in vitro de su efecto citotóxico
Autor : Rueda de A., Emma E.
Palabras clave : Proteasas
terpenos
látex
cultivos celulares in vitro
células Jurkat
actividad citotóxica
Calotropis procera
Pedilanthus tithymaloides
Proteases
terpenes
latex
in vitro cell cultures
Jurkat cells
cytotoxic activity
Calotropis procera
Pedilanthus tithymaloides
Fecha de publicación : 1-Nov-2012
Citación : 2012;1387-0011
Resumen : Con el objetivo de evaluar la acción citotóxica de enzimas con actividad proteasa y de fracciones terpenoides contenidas en el látex de las plantas tropicales Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton y Pedilanthus tithymaloides (L.) Poit., se colectaron muestras de ambos látices a partir de plantas adultas ubicadas en la zona norte del Estado Aragua. Las proteínas solubles fueron extraídas con 16 μL de acetato de sodio 50 mM pH 5/μg de látex integral y eliminada la porción poliisoprenoide por centrifugación a 16.000 x G durante 15 min, denominándose al sobrenadante ―extracto crudo de látex‖ (ECL). El ECL fue fraccionado exitosamente por cromatografía de intercambio iónico sobre carboximetilcelulosa con elución de las proteínas con gradiente de NaCl hasta 1 M. Las fracciones colectadas fueron probadas para actividad proteasa y Ribonucleasa (RNasa). Se estimó la masa molecular de las proteínas a través de ecuaciones de regresión lineal de la relación entre la distancia de migración y el Log de la masa molecular de las proteínas marcadoras. La fracción de terpenos se obtuvo a partir de extracciones con metanol sobre látex deshidratado y se llamó ―extracto metanólico de látex‖ (EML). Los ECL, las fracciones de proteasas y EML fueron probados en su actividad citotóxica in vitro sobre cultivos de células Jurkat mantenidas en medio básico RPMI-1640 con rojo de fenol, 0,2 % de bicarbonato de sodio, suplementado con 4 mM de L-glutamina, 10 % de SFB, penicilina (100 u/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) a 37° C en 5 % de CO2. Se realizaron estudios de viabilidad, proliferación, necrosis y apoptosis celular, utilizando las técnicas de reducción del MTT, exclusión del azul tripano y fluorescencia con naranja de acridina/bromuro de etidio. Los resultados indican que el látex de las especies estudiadas contienen enzimas con actividad proteasa y RNasa, con masas moleculares entre 28 y 30 kDa para ambas especies. El látex de C. procera presentó actividad proteasa sobre caseína, azocaseína, albúmina sérica bovina (ASB) y ovoalbúmina. La actividad sobre ovoalbúmina fue mayor a pH 5 y 70° C. El látex de P. tithymaloides no presentó actividad sobre ASB ni ovoalbúmina pero sí hidrolizó la caseína y la azocaseína. La actividad proteásica del ECL de P. tithymaloides sobre azocaseína fue óptima a pH 8,5 y 70° C. La proteína con actividad RNasa presente en el látex de P. tithymaloides es glicosilada. Los efectos citotóxicos del ECL y del EML de C. procera resultaron ser independientes de las dosis evaluadas, con efectos inhibitorios sobre la viabilidad y la proliferación celular en las 24 y 48 horas de incubación con dosis de 1 μg/mL, con porcentajes de inhibición del crecimiento celular entre 26 y 36 % con respecto al control a las 24 horas y entre 24 y 44 % a las 48 horas (ECL), y de 15 % a las 48 horas (EML). Las fracciones purificadas de proteasas no provocaron efectos citotóxicos sobre las células estudiadas. El ECL de P. tithymaloides presentó un efecto citotóxico dosis-dependiente sobre las células Jurkat a partir de 50 μg/mL (p<0,05). La inhibición del crecimiento celular fue de 16, 37 y 42 % al aplicar dosis de 10, 50 y 100 μg/mL, respectivamente, después de 24 horas de incubación. A las 48 horas, el crecimiento celular fue inhibido en proporciones semejantes (17, 34 y 40 % con dosis de 10, 50 y 100 μg/mL, respectivamente). El EML provocó efectos citotóxicos independientes de las dosis empleadas. Las fracciones purificadas de proteasas de P. tithymaloides no provocaron efectos citotóxicos sobre las células estudiadas.
Descripción : In order to assess the cytotoxic action of protease enzymes and terpenoid fractions contained in the latex from Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton and Pedilanthus tithymaloides (L.) Poit tropical plants, samples were collected from both adult plants located in the north of Aragua State. Soluble proteins were extracted with 16 μL of 50 mM sodium acetate pH 5/μg integral latex and eliminated the poly-isoprenoid portion by centrifugation at 16,000 x g for 15 min, the supernatant was named "latex crude extract" (LCE). The LCE was successfully fractionated by ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose, protein elution by gradient to 1 M NaCl. The fractions collected were tested for protease activity and ribonuclease (RNase). We estimated the molecular mass of proteins through linear regression equations of the relationship between migration distance and the Log of molecular mass marker proteins. The terpene fraction was obtained by extraction with methanol, dried and called "latex methanolic extract" (LME). The LCE and purified fractions were tested in vitro by cytotoxic activity in Jurkat cell cultures in RPMI media with phenol red, 0,2 % sodium bicarbonate, supplemented with 4 mM L-glutamine, 10 % foetal calf serum, penicillin (100 u/mL) and streptomycin (100 μg/mL) at 37º C in 5 % CO2. Cellular viability, proliferation, necrosis and apoptosis were evaluated using MTT assay, trypan blue exclusion and fluorescence staining with acridine orange/ethidium bromide. Results indicate that studied species latex contain enzymes with protease and Rnase activity, with molecular masses between 28 and 30 kDa for both species. The latex of C. procera showed protease activity on casein, azocasein, bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin. The activity on ovalbumin was higher at pH 5 and 70° C. The latex of P. tithymaloides no had activity on BSA or ovalbumin but hydrolyzed casein and azocasein. The protease activity of P. tithymaloides LCE on azocasein was optimal at pH 8,5 and 70° C. The RNase protein present in the latex of P. tithymaloides is glycosylated. The cytotoxic effects of C. procera LCE and LME were found to be dose-independent, with inhibitory effects on cell viability and proliferation at 24 and 48 hours of incubation at 1μg/mL, the cellular growth inhibition was between 26 and 36 % at 24 h and 24 - 44 % at 48 h (LCE), and 15 % at 48 h (LME). Protease purified fractions caused no cytotoxic effects on the studied cells. The P. tithymaloides LCE presented a dose-dependent cytotoxic effect on Jurkat cell from 50 μg/mL (p<0,05). The cellular growth inhibition was 16, 37 and 42 % with 10, 50 and 100 μg/mL respectively, after 24 h of incubation. At 48 h the cellular growth was inhibited in similar proportions (17, 34 and 40 % with doses of 10, 50 and 100 μg/mL, respectively). The LME caused dose-independent cytotoxic effects. Protease purified fractions caused no cytotoxic effects on the cells.
URI : http://saber.ucv.ve/123456789/1985
Aparece en las colecciones: Doctoral

Ficheros en este ítem:

Fichero Descripción Tamaño Formato
T026800003966-0-TESIS_EMMA_RUEDA-000.pdf1.93 MBAdobe PDFVisualizar/Abrir

Los ítems de DSpace están protegidos por copyright, con todos los derechos reservados, a menos que se indique lo contrario.

 

Valid XHTML 1.0! DSpace Software Copyright © 2002-2008 MIT and Hewlett-Packard - Comentarios