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Título : Análisis del proceso de traducción in vitro de cepas del virus dengue e inhibición de este mecanismo mediante el uso de oligonucleótidos antisentido
Autor : Camacho García, Daría Elena
Palabras clave : Dengue
oligonucleótidos antisentido
traducción in vitro
transcripción in vitro
Fecha de publicación : 2016
Editorial : UCV
Citación : 2016;1425-001
Resumen : El DENV es un flavivirus cuyo genoma es un ARN de aproximadamente 10700 nucleótidos, consituída en sus extremos 5´y 3´terminal por regiones no traducibles (UTR). La funcionalidad de estos extremos se ha asociado con eventos de supervivencia viral, tales como la replicación y síntesis de proteínas. Este último mecanismo ha sido escasamente dilucidado. El objetivo del presente estudio fue analizar el proceso traduccional in vitro de cepas de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, y su inhibición con oligonucleótidos antisentido. Para lograrlo, se obtuvieron los ARN´s de los DENV que fueron incorporados a un sistema de traducción in vitro obtenido de placenta humana haciendo uso de la fracción postmitocondrial (S30) como fuente de ribosomas y factores solubles. Se observaron diferentes porcentajes de estimulación del sistema en relación al control, específicamente DENV-1 (16007) ~45%, DENV-3 (H87) ~30%, DENV-4 (H- 241) ~60%, mientras que las cepas de DENV-2 -independiente del genotipo viralestimularon el sistema en ~50%. Verificada la capacidad de estimulación traduccional los ARNv, se realizaron ensayos de inhibición de este mecanismo haciendo uso de moléculas antisentido dirigidas contra las estructuras SLA, SLB, CS1 del genoma de DENV-2. Los resultados mostraron un efecto inhibitorio, exceptuando el dirigido contra la secuencia ubicada entre los nucleótidos 119 y 141 correspondiente a la cápside viral. Posteriormente, se analizó el efecto inhibitorio de una molécula dirigida contra una secuencia ubicada entre los nucleótidos 80 y 99, previo al codón de inicio AUG, incluyéndolo. Los valores de inhibicion fueron 47, 38 y 100%, para los ARNv de DENV-1, DENV-3 y DENV-4; respectivamente. Adicionalmente, con el fin de obtener transcritos de DENV-2 se amplificaron mediante RT-PCR los fragmentos 5´UTR-C para clonarlos en el plásmido comercial pGEM®-T Easy justo en la secuencia ubicada luego del promotor T7 para obtener -mediante reacciones de transcripción in vitro con T7 ARN polimerasa- transcritos de 320 pb. Posteriormente, haciendo uso de los plásmidos recombinantes se amplificaron productos de 345 pb que abarcaban la región promotora T7 y 5´UTR-C, estos fueron sometidos a transcripción in vitro en condiciones similares lo que dio lugar a la obtención de los transcritos. Los resultados demostraron eficiencia traduccional por parte de genomas de DENV, sugiriendo un proceso canónico para la síntesis de proteínas que pudo ser inhibido con moléculas antisentido. Asimismo, se obtuvieron transcritos de la región iniciadora 5´UTR-C susceptibles a ser analizados en ensayos posteriores en el sistema traduccional mencionado, lo que permitiría comparar estrategias de traducción in vitro. El bloqueo observado con las moléculas antisentido sugiere su uso para dilucidar aspectos relacionados con el mecanismo de síntesis de proteínas, así como para el diseño y puesta en marcha de estrategias antivirales contra DENV y cualquier otro virus de tipo ARN.
URI : http://hdl.handle.net/123456789/15874
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