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Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://hdl.handle.net/123456789/1559

Título : Evaluación de la hemostasia en perros de raza beagle infectados experimentalmente con una cepa de anaplasma platys
Autor : Oviedo Sosa, Miledys A.
Palabras clave : infección experimental
Anaplasma platys
caninos
coagulación sanguínea
anticuerpos antiplaquetas
fibrinólisis
hematología
experimental infection
canine
blood coagulation
antiplatelet
antibodies
fibrinolysis
hematology
Fecha de publicación : 16-Jul-2012
Citación : 2012;1425-0001
Resumen : Se condujo un estudio para evaluar, durante un mes, el efecto de la infección experimental con Anaplasma platys Maracay sobre la hemostasia primaria(agregación plaquetaria (AP), secreción plaquetaria (SP), Factor von Willebrand (FvWAg), hemostasia secundaria (TP, TTPa, concentración de fibrinógeno (CF), Factor XIII), fibrinólisis (dímero D, tiempo de lisis de euglobulina (TLE)), presencia de anticuerpos anti-plaquetas (IgGAP) y la hematología(plaquetas, hemoglobina, hematocrito, leucocitos, fórmula leucocitaria) en seis perros Beagles sanos, de 1 año de edad. El inóculo se preparó, en una primera instancia, a partir de la sangre de una cachorra pastor alemán, infectada naturalmente con A. platys, con 15% de bacteriemia, diagnosticada por observación directa de la bacteria en el frotis de capa blanca (FCB) teñidos con Giemsa, mediante microscopía de luz y consistió de un plasma rico en plaquetas infectadas (PRP). Con el fin de amplificar y probar la eficacia de este aislado, éste fue inoculado en tres perros mestizos, alcanzando 99% de infección única con A. platys en uno de ellos e infección moderada (30 y 5%) en los otros dos. El PRP (30 mL) obtenido del perro con 99% de bacteriemia constituyó el inóculo utilizado en los Beagles y contenía 143.000 plaquetas/μL, de las cuales 90 % presentaban inclusiones compatibles con A. platys, observadas por FCB y por evaluación de la ultraestructura de la bacteria con microscopía electrónica de transmisión (MET). Todos los Beagles fueron diagnosticados por FCB, serología (IFI) y por PCR, como negativos a A. platys y a E. canis, previo a la inoculación con el aislado. El experimento consistió en evaluar antes y después de la inoculación del aislado de A. platys Maracay, las variables hemostáticas, hematológicas y serológicas antes mencionadas. Cada perro fue su propio control (pre y postinoculación). Se realizó un seguimiento diario de la infección mediante la observación del FCB, medición del recuento de plaquetas, hematocrito y temperatura rectal. Todos los Beagles resultaron A. platys (+) y E. canis (-) post inoculación. Se estudió la secuencia parcial del ADNr 16S de A. platys de la muestra de ADN aislada del PRP de uno de los perros infectados, comprobándose la alta similitud con varias cepas de A. platys registradas en el Banco de Genes, evidenciándose también su cercanía a A. platys Venezuela (AF287153). La bacteriemia en los Beagles fue cíclica, con un periodo de incubación promedio de 8 días. Hubo tres picos de bacteriemia en el mes de observación en 4 de los perros y dos picos en los restantes. Estos picos se repitieron cada 10 días aproximadamente, siendo el 1er pico (26%) considerablemente mayor al segundo (5%) y tercero (8%). La temperatura corporal se elevó en todos los picos, llegando solo en algunos casos a evidenciarse fiebre. Los Beagles presentaron decaimiento e inapetencia en los picos de infección, pero no pudo ser observada la presencia de petequias ni de hemorragias. El recuento de plaquetas disminuyó significativamente en los tres picos de bacteriemia, desarrollándose una trombocitopenia cíclica, que llegó a ser severa (hasta 1.000 plaquetas/μL), cuya causa aparentemente fue multifactorial. Cada pico fue seguido de un periodo de recuperación, con valores normales de plaquetas e inclusive con trombocitosis en algunos de los perros. También pudo ser observada la presencia de macroplaquetas en la fase aguda de la infección, principalmente en el primer pico de bacteriemia. Se desarrolló una anemia normocítica normocrómica significativa y una disminución no significativa de los leucocitos en todos los picos de bacteriemia. La inoculación con A. platys disminuyó la AP y la SP de ATP, de las plaquetas inducidas con colágeno, en los dos primeros picos de infección, así como la SP de ATP inducida con trombina. En cambio la SP de ATP expresada a 1011 plaquetas, e inducida con ambos agonistas, no fue afectada por la infección, por lo que aparentemente hay una contribución de la trombocitopenia a la disminución de la función plaquetaria. No pudo observarse efecto de A. platys sobre los niveles plasmáticos del FvW-Ag ni sobre los TLE, por lo que pareciera que no hubo daño endotelial. La infección tampoco afectó a los tiempos de coagulación TP y TTPa, ni a la presencia del FXIII. En cambió si fue incrementada significativamente la CF en todos los picos de infección, comportándose como un reactante de fase aguda. La infección no provocó hiperfibrinolisis, ya que el dímero D y el TLE no fueron afectados. Aparentemente tampoco se desarrolló una coagulación intravascular diseminada (CID). No se detectó un incremento de IgGAP en el primer episodio de infección (27% de bacteriemia), con trombocitopenia severa, pareciendo que ésta se debiera al daño directo ocasionado por la bacteria sobre la plaqueta. Los Beagles 1, 2, 5 y 6 elevaron IgGAP de 9, 16, 10 y 16% a 50, 85, 31 y 90% respectivamente, en la 4a semana postinfección, con una disminución no trombocitopénica de los recuentos plaquetarios a excepción del perro 6 que manifestó trombocitopenia severa. Se concluye que la infección por A. platys produjo una disfunción plaquetaria adquirida, en parte debida a la dramática disminución del recuento plaquetario, por otra parte, la presencia de anticuerpos antiplaquetas detectados en el suero de algunos animales enfermos, con recuentos plaquetarios disminuidos apoyan la idea de un mecanismo inmunopatogénico para la trombocitopenia, no afectándose, por otra parte, las variables estudiadas de la hemostasia secundaria ni de la fibrinólisis.
A one-month study was conducted to assess the effect of experimental infection with Anaplasma platys Maracay on primary hemostasis (platelet aggregation (PA), fibrinolysis, platelet secretion (PS), von Willebrand Factor antigen (vWFAg), secondary hemostasis (PT, aPTT, Fibrinogen concentration (FC), Factor XIII); (Dimer D, euglobulin lysis time (ELT), presence of antiplatelets antibodies (IgGAP), and hematalogy (platelets count, hemoglobin, hematocrit, leukocytes count, differential white cells count). A total of six healthy Beagle dogs of one year of age were used. The inoculum (I) prepared in first instance, was obtained from a German shepherd puppy, naturally infected with A. platys, with 15% of bacteremia, diagnosed by direct observation of the bacteria in buffy coat blood smear (BCS), stained with Giemsa, under light microscopy. The I consisted of plasma enriched with infected platelets (PEIP). In order to amplify and test the effectiveness of this I, this was inoculated in three mix bred dogs. One dog reached 99% of bacteremia, the other two, reached 30 and 5%, respectively. The PEIP obtained from the dog with highest bacteremia became the I used in experimental dogs, and contained 143,000 platelets/μL, from which 90% showed inclusions compatible with A. platys, observed with BCS, and through evaluation of the observation of the ultramicroscopic structure of the bacterium, using transmission electronic microscopy (TEM). Previous to inoculation, all experimental animals resulted negative to A. platys and E. canis with BCS, serology (IFA) and PCR. The aforementioned hematological variables were assessed before and after inoculation of A. platys Maracay. Each dog became its own control (before and after infection). A daily follow-up of infection was done by direct observation of BCS, platelets count, hematocrit, and rectal temperature (RT). After infection, all dogs were positive to A. platys and negative E. canis. The partial sequence of DNAr 16S of A. platys, isolated from the PEIP of one of the infected dogs, was studied. At the same time, a high similarity of this sequence with various strains of A. platys deposited in the GeneBank, was found. A high phylogenetic relationship with A. platys Venezuela (AF287153) was also seen. Beagles bacteremia was cyclic, with an incubation period of 8 days. During the month of observation there were 3 peaks of bacteremia in 4 dogs, and 2 peaks in the rest. These peaks were repeated every 10 days, with the first peak considerably higher (26%) than the second (5%), and the third (8%), respectively. The RT raised in all peaks, resulting in fever in few cases. Animals showed weakness and lack of appetite in infection peaks, but presence of petechiae or hemorrhage was not evidenced. Platelet count significantly diminished (P<0,05) in all 3 peaks, developing a severe cyclic thrombocytopenia (up to 1,000 platelets/ μL), with an apparent multifactor origin. Each peak was followed by a recovery period, with normal values, and even with thrombocytosis in some dogs. Presence of macroplatelets could be observed during the acute infection phase, mainly in the first peak of bacteremia. It was developed significant normocytic normochromic anemia and a non-significant decrease of white blood cells in all the peaks of bacteremia. The inoculation of A. platys reduced both, the collagen-induced PA and the collagen-induced and thrombin-induced ATP PS during the first infection peaks. In contrast, when ATP PS was normalized as 1011 platelets, then the PS induced by both agonists was not affected by the infection. Therefore, it is possible that the thrombocytopenia contributed to the reduction of platelet function. The infection did not induce endothelial injury because the plasmatic concentration FvW-Ag and ELT were not modified. The infection neither affected the coagulation times (PT and aPTT) nor the presence of FXIII. On the other hand, there was a significant increase of FC during all the infection peaks, behaving as a classical acute phase protein. The infection did not induce hyperfibrinolysis because the D dimer concentration and ELT were not modified. Apparently, there were no evidence of disseminated intravascular coagulation (DIC). Although there were 27% bacteremia and severe thrombocytopenia throughout the first episode of infection, there was no increase of serum IgGAP. It is likely that the thrombocytopenia was caused by a direct damage of the bacteria to the platelet. There was a rise in the percentage of IgGAP in beagles 1 (9 to 50%), 2 (16 to 85%), 5 (10 to 31%) and 6 (16 to 90%) during the fourth week after infection. Simultaneously, there was also a reduction of the platelet count without reaching a thrombocytopenic threshold; however, beagle number 6 displayed a severe thrombocytopenia. In conclusion, the A. platys infection induced a platelet acquire dysfunction partially due to the dramatic reduction in platelet count. Additionally, the presence of antibodies against platelets detected in some of the infected-beagles, along with reduced platelet count, supports the hypothesis of an inmunopathogenic mechanism behind the thrombocytopenia, without affecting the secondary hemostasis and fibrinolysis studied variables.
URI : http://saber.ucv.ve/123456789/1559
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