Desarrollo de la técnica de amplificación isotérmica de ADN mediada por ASAS (LAMP) para su aplicación en la detección de Trypanosoma vivax en ovinos infectados experimentalmente

Abstract

Trypanosoma vivax es el principal agente causal de la tripanosomosis en rumiantes. Esta enfermedad se distribuye por países tropicales y subtropicales de Asia, África y América del Sur, afectando la productividad y salud de diversas especies ganaderas tales como bovinos, ovinos, búfalos y caprinos. En Venezuela, ha demostrado ser de carácter endémico, causando diversas patologías importantes que afectan directamente la sobrevivencia de los animales infectados. En vista de la importancia de T. vivax, es necesaria la aplicación de nuevos métodos de diagnóstico que sean rápidos, sensibles, sencillos, económicos y potencialmente aplicables en campo. La reacción de amplificación isotérmica de ADN mediada por asas (LAMP) es un nuevo método específico, sensible y de bajo costo comparado otros métodos de diagnóstico. En este estudio se desarrolló la técnica LAMP para su aplicación en la detección de T. vivax en ovinos infectados experimentalmente, empleando la secuencia de la región catalítica de la cisteína proteasaPara ello, se inoculó un ovino mestizo sano con el aislado Apure de T. vivax y se llevaron a cabo seguimientos continuos de parámetros clínicos y parasitológicos. Se incluyeron en el estudio, técnicas como microhematocrito, Woo, y gota fresca. Para el análisis molecular se utilizó el ensayo Tv-LAMP empleando cebadores específicos y se comparó con la técnica de PCR. Los resultados mostraron que la técnica LAMP fue específica para la detección de T. vivax con una sensibilidad de 1trip/mL de sangre a diferencia de la sensibilidad obtenida por PCR la cual fue de 10trip/mL. Así mismo, mostró ser robusta al detectar el ADN del parásito a partir de la capa blanca obtenida de sangre infectada y en sangre tratada con buffer de lisis, disminuyendo el tiempo del procesamiento de la muestra. Los resultados positivos fueron evidenciados por electroforesis en geles de agarosa, SYBR Green y turbidez derivada de la formación de pirofosfato de magnesio. LAMP demostró ser una técnica de fácil riesgo de contaminación por amplicones por lo que el empleo del aceite mineral como barrera entre el medio externo e interno del tubo de reacción mostró ser un método efectivo en la prevención de contaminación de los productos. La técnica Tv-LAMP mostró ser capaz de detectar T. vivax en ovinos infectados con alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, se requieren estudios a futuros para validar el ensayo Tv-LAMP en condiciones de campo.