Estandaización de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple para la detección VIH-1 a partir de ADN proviral proveniente de pacientes referidos al Instituto Nacional de Higiene "Rafae Rangel"

Abstract

Resumen El diagnóstico temprano de la infección perinatal por el VIH-1 es importante para su manejo clínico temprano antes de que aparezcan complicaciones derivadas de la infección de VIH y mejorar así la calidad y esperanza de vida del paciente. El objetivo de este trabajo es la estandarización de una PCR-múltiple anidada, para amplificar las regiones conservadas env y gag del VIH-1. Para ello se analizaron 60 muestras sanguíneas de niños, entre edades comprendidas de 15dias a 24meses, referidos al Instituto de Higiene “Rafael Rangel” (INHRR). Todas las muestras se colectaron de manera estéril con EDTA, seguido de una centrifugación para la extracción de la capa leucocitaria o Buffy Coat, Posteriormente el ADN proviral fue extraído mediante el kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit. Se realizó un Análisis bioinformático de los “primers” empleados en la identificación; donde se puede inferir que los cebadores son muy específicos en relación con sus objetivos respectivos como se confirmó a partir de los resultados BLAST y PCR in sillico. Seguido se realizaron cambios en la mezcla de reacción y programa de amplificación de la PCR convencional, logrando estandarizar la PCR Múltiple cebadores específicos de la región Gag (209) y la región Env (337pb) del VIH-1, con la adición de un control de beta-globina (268pb). Para la visualización del producto amplificado, se realizó una electroforesis en gel de agarosa a 2% con tinción con bromuro de etidio. El límite de detección (valor hasta cuantas copias del virus puede llegar a detectar el método), se presentó en la dilución 1:125, que equivale a 2545 copias/ml. Para evaluar la especificidad analítica del ensayo, se usaron 15 muestras de pacientes infectados con VHB, VHC o CMV, los cuales no revelaron ninguna banda de amplificación. Para validar la sensibilidad y especificidad de la PCR Múltiple estandarizada, se comparó los resultados obtenidos de la PCR estandarizada con los resultados de PCR convencional del “laboratorio de Hepatitis y Sida” usada como estándar de referencia, obteniéndose una sensibilidad de 100% y una especificidad de 93,75%, con un Kappa de Cohen de 0,96. De esta manera se logró estandarizar la técnica de PCR Múltiplex, para su aplicación en el diagnóstico clínico lo que permitirá optimizar los protocolos de detección del VIH-1 con un menor gasto de reactivos, corroborando así la utilidad de la PCR como herramienta molecular en el diagnóstico oportuno de la infección perinatal por el VIH-1. Palabras claves: VIH, PCR múltiple, diagnostico, transmisión vertical.