Aislamiento y purificación de proteasas y una fracción enriquecida en terpenos de látex de Calotropis procera y Pedilanthus tithymaloides y evaluación in vitro de su efecto citotóxico

Abstract

Con el objetivo de evaluar la acción citotóxica de enzimas con actividad proteasa y de fracciones terpenoides contenidas en el látex de las plantas tropicales Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton y Pedilanthus tithymaloides (L.) Poit., se colectaron muestras de ambos látices a partir de plantas adultas ubicadas en la zona norte del Estado Aragua. Las proteínas solubles fueron extraídas con 16 μL de acetato de sodio 50 mM pH 5/μg de látex integral y eliminada la porción poliisoprenoide por centrifugación a 16.000 x G durante 15 min, denominándose al sobrenadante ―extracto crudo de látex‖ (ECL). El ECL fue fraccionado exitosamente por cromatografía de intercambio iónico sobre carboximetilcelulosa con elución de las proteínas con gradiente de NaCl hasta 1 M. Las fracciones colectadas fueron probadas para actividad proteasa y Ribonucleasa (RNasa). Se estimó la masa molecular de las proteínas a través de ecuaciones de regresión lineal de la relación entre la distancia de migración y el Log de la masa molecular de las proteínas marcadoras. La fracción de terpenos se obtuvo a partir de extracciones con metanol sobre látex deshidratado y se llamó ―extracto metanólico de látex‖ (EML). Los ECL, las fracciones de proteasas y EML fueron probados en su actividad citotóxica in vitro sobre cultivos de células Jurkat mantenidas en medio básico RPMI-1640 con rojo de fenol, 0,2 % de bicarbonato de sodio, suplementado con 4 mM de L-glutamina, 10 % de SFB, penicilina (100 u/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) a 37° C en 5 % de CO2. Se realizaron estudios de viabilidad, proliferación, necrosis y apoptosis celular, utilizando las técnicas de reducción del MTT, exclusión del azul tripano y fluorescencia con naranja de acridina/bromuro de etidio. Los resultados indican que el látex de las especies estudiadas contienen enzimas con actividad proteasa y RNasa, con masas moleculares entre 28 y 30 kDa para ambas especies. El látex de C. procera presentó actividad proteasa sobre caseína, azocaseína, albúmina sérica bovina (ASB) y ovoalbúmina. La actividad sobre ovoalbúmina fue mayor a pH 5 y 70° C. El látex de P. tithymaloides no presentó actividad sobre ASB ni ovoalbúmina pero sí hidrolizó la caseína y la azocaseína. La actividad proteásica del ECL de P. tithymaloides sobre azocaseína fue óptima a pH 8,5 y 70° C. La proteína con actividad RNasa presente en el látex de P. tithymaloides es glicosilada. Los efectos citotóxicos del ECL y del EML de C. procera resultaron ser independientes de las dosis evaluadas, con efectos inhibitorios sobre la viabilidad y la proliferación celular en las 24 y 48 horas de incubación con dosis de 1 μg/mL, con porcentajes de inhibición del crecimiento celular entre 26 y 36 % con respecto al control a las 24 horas y entre 24 y 44 % a las 48 horas (ECL), y de 15 % a las 48 horas (EML). Las fracciones purificadas de proteasas no provocaron efectos citotóxicos sobre las células estudiadas. El ECL de P. tithymaloides presentó un efecto citotóxico dosis-dependiente sobre las células Jurkat a partir de 50 μg/mL (p<0,05). La inhibición del crecimiento celular fue de 16, 37 y 42 % al aplicar dosis de 10, 50 y 100 μg/mL, respectivamente, después de 24 horas de incubación. A las 48 horas, el crecimiento celular fue inhibido en proporciones semejantes (17, 34 y 40 % con dosis de 10, 50 y 100 μg/mL, respectivamente). El EML provocó efectos citotóxicos independientes de las dosis empleadas. Las fracciones purificadas de proteasas de P. tithymaloides no provocaron efectos citotóxicos sobre las células estudiadas.