Modelado Molecular de la Enzima 6-Fosfogluconato Deshidrogenasa y su Aplicación en el Diseño Racional de Fármacos para la Leishmaniasis.

Abstract

La 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGDH) es la tercera enzima de la ruta de las pentosas fosfato y ha mostrado ser esencial en la generación del poder reductor en forma de Nicotinamida Adenina Dinucleotido Fosfato (NADPH) que protege al parásito contra estrés oxidativo; razón por la que es considerada como un potencial blanco terapéutico. Estructuralmente la 6-PGDH es homo-dimérica y se ha relacionado el número de interacciones entre ambas sub-unidades con su estabilidad cinética en Kinetoplastidas. En la forma cristalina de Tripanosoma brucei se han identificado cinco puentes salinos que ayudan a mantenerlas unidas para formar el dímero: puente 1 R459 → E134, puente 2 E477 → K139, puente 3 E463 → R259, puente 4 R464 → D246 y puente 5 D466 → H255. Las enzimas 6-PGDH de Tripanosoma cruzi y Leishmania (Leishmania) mexicana son inestables y no se encuentran cristalizadas. En este trabajo se realizó el modelaje molecular de la enzima 6-PGDH de L. (L.) mexicana y T. cruzi, y sus correspondientes enzimas mutadas in silico, a objeto de evaluar mediante dinámica molecular el comportamiento de los residuos que forman los pares iónicos de interés. El análisis estructural en base a las trayectorias obtenidas ha permitido encontrar argumentos para explicar la inestabilidad de la 6-PGDH en Kinetoplastidas en relación con la ausencia de algunos puentes salinos y su ubicación en la estructura tridimensional de la enzima. Los resultados muestran que el puente 2 parece ser esencial en la actividad catalítica ya que en la estructura de la 6-PGDH se ubica en la entrada al sitio activo, enlazando ambas sub-unidades del dímero mediante los últimos residuos del tallo (extremo C-terminal). La obtención de un modelo tridimensional validado para la enzima de L. (L.) mexicana permitió realizar el barrido virtual en base al receptor de una librería química, que fue construida por similaridad estructural con inhibidores de altos porcentajes de inhibición ensayados experimentalmente para la 6-PGDH de T. brucei. Mediante esta aproximación se encontraron tres compuestos (1, 3, 5) con propiedades ADME tipo fármaco, que muestran mayor afinidad por la enzima de L. (L.) mexicana en comparación a su contraparte humana. Las diferencias encontradas para la cavidad de la enzima en parásito y humana pueden seguir explotándose en el diseño racional de fármacos contra la leishmaniasis, en particular el hallazgo de la influencia del tallo en la cavidad y la interacción con los residuos Y194, R454 y H460 que pertenecen a la otra sub-unidad y son los encargados de anclar el sustrato al sitio activo. Abstract The 6PGDH is a homo-dimeric and a key enzyme to protect parasite against oxidative stress. In Trypanosoma brucei 6-PGDH inter sub-units salt bridges are important in the maintenance of its quaternary structure: bridge 1 R459 → E134, bridge 2 E477 → K139, bridge 3 E463 → R259, bridge 4 R464 → D246 and bridge 5 D466 → H255. Site-directed mutagenesis experiments on 6-PGDH of T. cruzi suggested that the observed kinetic instability could be due to weak associations between both sub-units; in this enzyme two bridges are missing (3 and 4). The 6-PGDH of L. (L.) mexicana is also unstable, the salt bridge 2 is missing and little is known about the role that those interactions play in their structure. We ran molecular dynamics of 5 ns for three native enzymes and two in silico mutants. The distances between residues of mentioned ionic pairs over time were analyzed. Resulting trajectories reveals that in L. (L.) mexicana ionic pairs 3 and 4 are not salt bridges (distances around 5‒6 Å). In silico mutations reestablished interactions on L. (L.) mexicana and T. cruzi enzymes and they helped to interpret the role of studied ionic pairs. Ionic pair 2 appears to be essential to enzymatic activity because it could act like a zipper to this cavity. The differences found in Leishmania, T. cruzi, and T. brucei native enzymes suggested that 6-PGDH can be further study as a potential target for the developing new drugs to improve existing chemotherapy treatments. The obtained model for 6-PDGH of L. (L.) mexicana allowed to screen virtually a chemical library built by structural similarity with founded inhibitors for T. brucei. The search yielded three compounds (1, 3 and 5) with drug-like properties and higher affinity for parasitic enzyme in comparison with human counterpart. The differences found between species support the use of 6-PGDH as selective therapeutic target. In particular the tail influence in shaping active site cavity and interactions with other sub-unit residues Y194, R454, H460.