Aplicaciones de Calibración Multivariada en la Determinación de Algunos analitos orgánicos en muestras de agua mediante la Técnica de Fluorescencia Molecular

Abstract

La aplicación de la calibración multivariada (CM) en el área de la química analítica, ha marcado un precedente en el análisis multi-componente de muestras complejas. Mediante esta calibración, es posible interpretar la información multivariable suministrada por diversos análisis químicos y concentrarla en un pequeño número de variables latentes (componentes principales) que contienen la información química de mayor relevancia. Esto ha permitido utilizar técnicas de espectros completos, tales como espectroscopia de infrarrojo y de absorción y fluorescencia molecular en la determinación cuantitativa de un elevado número de compuestos en una amplia diversidad de muestras, ya sea mediante análisis simultáneo o en presencia de otras especies interferentes. En este sentido, en este trabajo se planteó el uso de modelos de CM mediante algoritmos de mínimos cuadrados parciales PLS en la cuantificación simultánea de analitos orgánicos en muestras de agua, mediante fluorescencia molecular. En una primera etapa del estudio, se realizó la determinación simultánea semi-cuantitativa de dos hidrocarburos aromáticos poli-cíclicos (HAPs): antraceno (Ant) y pireno (Pir) en muestras de agua potable. Para la determinación de los HAPs se utilizaron tres configuraciones experimentales: a) un láser pulsado Nd-YAG a 355nm (sistema 1) y b) una lámpara de arco de xenón (sistema 2). En ambos casos se registro la señal analítica mediante un detector simultáneo CCD. En la tercera configuración experimental se modificó el sistema de detección de la fluorescencia inducida por láser (LIFs), empleando un sistema de integración boxcar junto con un detector de respuesta rápida (sistema 3). Para los tres sistemas de medidas, fueron evaluadas las propiedades fluorescentes de los HAPs en diferentes medios de disolución: medio orgánico, medio acuoso y medio micelar. En el sistema 1, se escogió el medio micelar y en el sistema 2 la determinación de los analitos se realizó en medio orgánicoDiferentes estrategias fueron utilizadas para la construcción de los conjuntos de calibración y validación empleados en la CM. Se utilizaron diseños multinivel: diseño factorial 52, matriz de doehlert y planteamiento de conjuntos de calibración simplificados, formado por un pequeño número de muestras. En los conjuntos anteriores, fueron aplicados los algoritmos de calibración multivariante con regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS): PLS1 y PLS2. El ajuste de ambos modelos de calibración y la capacidad predictiva de estos, se evaluó mediante validación cruzada interna y validación externa. Los resultados obtenidos por validación externa indican que la matriz de Doehlert resultó ser un diseño de calibración más eficiente que el diseño factorial para realizar la determinación de antraceno y pireno en medio micelar por CM. Por otro lado, los mejores valores del error de predicción relativo (RRMSEP) : del 5% para el antraceno y 6% para el pireno, fueron obtenidos cuando se utilizó un conjunto de calibración y validación simplificado. Se demuestra entonces que la construcción del modelo de calibración influye en la eficiencia del modelo PLS, en este estudio se obtiene una predicción satisfactoria de los analitos por validación externa sin requerir el uso de un elevado número de estándares de calibración. La aplicación de los modelos PLS1 y PLS2, permitió la determinación semicuantitativa de antraceno y pireno en presencia de la matriz de compuestos inorgánicos de muestras de agua potable, sin separación previa de los analitos. Se analizaron cuatro muestras, con el modelo PLS1, se obtienen porcentajes de recuperación entre el 88 y el 112 % del antraceno y del 88 y 75% para el pireno. En el modelo PLS2, la recuperación del antraceno varía del 117% al 84% y la del pireno va desde el 98 al 49%, indicando este último valor una poca capacidad predictiva respecto a esta muestra.En una segunda etapa de este trabajo de investigación, se desarrollo la determinación selectiva de la Clo “a” en sistemas acuáticos. En una primera fase experimental se utilizó la técnica de fluorescencia molecular y en una segunda fase la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Inicialmente fueron ensayados dos procedimientos de extracción de pigmentos: a) método 1F-0,45 y b) método SPE C-18; en el primero se utilizó un filtro de membrana de nylon de 0,45 μm y diámetro de 12mm, como medio filtrante para la retención del fitoplancton. En el segundo procedimiento se realiza la extracción en fase sólida (SPE) en cartuchos C-18, de los organismos del fitoplancton contenidos en las muestras analizadas. En ambos procedimientos se utilizó etanol como solvente de extracción. Se aplicó el procedimiento de “spiking” sobre las muestras analizadas, para evaluar la eficiencia de estos métodos de extracción. Se comparó entonces la aplicación de modelos de calibración univariados, curva de calibración externa y adición de estándar con modelos multivariados PLS sobre las muestras “spiked”. Se obtiene que la mejor eficiencia de extracción para la Clo “a” fue alcanzada por el método 1F-045, ya que se obtienen porcentajes de recuperación cercanos al 100%. Esto indica pérdidas mínimas del analito durante la extracción y la ausencia de errores sistemáticos. No obstante el método 1F-0,45 no fue eficiente en la extracción de la Clo “b”. Una pobre eficiencia en la recuperación de la Clo “a” y la Clo “b” en las muestras fue obtenida con el procedimiento SPE C-18. Por otro lado, en todos los casos hay un incremento en la exactitud del análisis mediante la aplicación de los modelos PLS1. . Bajo las condiciones óptimas de los procedimientos de extracción, se realizó la determinación selectiva de la Clo “a” por fluorescencia en muestras de agua de mar y de reservorio alcanzado un límite de detección de 1,8 μg L-1. La concentración de Clo “a” encontradas en las muestras se encontró por debajo de los límites de detección.En la segunda fase experimental de este estudio, fueron establecidos dos métodos isocráticos de separación por HPLC convencional y HPLC capilar para la determinación rápida y sensible de Clo “a” en muestras de aguas de mar, de reservorio y de vertido de depuradora. Por HPLC convencional se alcanzo un LOD de 4 μg L-1 y por HPLC - Capilar de 0,46 μg L-1. Un aumento en la sensibilidad de la determinación por HPLC fue alcanzado, mediante un sistema de pre-concentración en línea de los analitos, de micro extracción en fase sólida (SPME) en tubo en una fase estacionaria de polidimetilsiloxano (PDMS) de una columna capilar abierta de Cromatografía de gases (CG), acoplado a ambos sistemas cromatográficos utilizados. Finalmente, se comparó la técnica de HPLC convencional con SPME en tubo y la de fluorescencia molecular en el análisis de muestras “spiked”, obteniendo un elevado coeficiente de correlación entre los métodos de r2 de 0,9874. Los resultados obtenidos mediante estas técnicas permitió validar el método 1F 0,45 como método de extracción de la Clo “a”. El siguiente trabajo de investigación fue presentado en este manuscrito, en una secuencia de tres capítulos. El primero corresponde a un marco teórico donde se presentan conceptos básicos acerca de la CM y la técnica de fluorescencia molecular. El segundo capítulo se divide en dos secciones: en la primera se presentó una breve revisión bibliográfica los HAPs, sus propiedades, técnicas de análisis y algunos antecentes sobre la aplicación de CM en la cuantificación de los estos. En la segunda sección se presentan los resultados experimentales obtenidos mediante la aplicación de diversas estrategias de CM y fluorescencia molecular en la determinación de antraceno y pireno en muestras de agua potable. El tercer capítulo esta dividido en tres secciones: la primera consiste de una revisión bibliográfica del proceso de determinación de Clo “a” en sistemas acuáticos. En la segunda sección se presentan los resultados obtenidos, mediante el desarrollo de un método fluorométrico y la aplicación de CM para la determinación selectiva de la Clo “a”. En la tercera sección se presentan los resultados obtenidos mediante la aplicación de métodos HPLC en la determinación de la Clo “a”.